REMEDI - Aktuelles

Meetings

27.04.2010: Kickoff-Meeting in Gräfelfing, Deutschland (TILL Photonics)

31.03.2011: 1. Jahrestreffen in Nijmegen, Niederlande (RUNMC)

Ergebnisse der ersten Projektperiode (01.01.2010 - 30.06.2011)

Das Funktionieren oder Nicht-Funktionieren des Organismus eines Patienten sollte sich direkt in zuverlässigen diagnostischen Kriterien widerspiegeln. Da die meisten Krankheiten letztlich bis zum Versagen der den zellulären Prozessen zugrundeliegenden molekularen Maschinerie zurückverfolgt werden können, sollte sich die Diagnose idealerweise auf die direkte Beobachtung der relevanten molekularen Ereignisse stützen anstatt bloß auf die organismischen Erscheinungen. Es ist jedoch nicht nur die Anwesenheit oder Abwesenheit von molekularen Komponenten, sondern ihre Wechselwirkung, die über die Gesundheit der Zelle entscheidet. Deshalb stellt die räumliche Auflösung einen nicht zu ersetzenden Vorteil in der Diagnostik dar.

Wechselwirkungen, die für die zellbasierte Diagnostik relevant sind, überspannen einen weiten Längenbereich: Protein-Protein-Wechselwirkungen treten im Nanometer-Bereich auf, Proteinkomplexe und Proteincluster messen mehrere Dutzend bis Hunderte von Nanometern und die funktionelle Umlagerung von Proteinen zu zellulären Unterstrukturen kann im Bereich von Hunderten Nanometern bis hin zu mehreren Mikrometern beobachtet werden.

Leider können konventionelle Mikroskopietechniken nur bis in Längenbereiche von 200 nm aufwärts (Lichtmikroskopie) vordringen, oder aber sie sind beschränkt auf eine geringe Zahl von Zielproteinen in fixierten Proben (Elektronenmikroskopie). Das Ziel von REMEDI ist es deshalb, kürzlich entwickelte Techniken der Einzelmolekülbildgebung für die Verwendung in der medizinischen Diagnostik anzupassen, um die Fragen der Anwesenheit, Wechselwirkung und räumlichen Verteilung von Proteinen in Gewebeproben und lebenden Zellen mit ultrahoher Empfindlichkeit zu adressieren.

Konventionelle Mikroskope sind für die Stabilitätsanforderungen der Hochauflösung nicht so gut geeignet. Die Stabilität hängt in kritischem Maße von der Vibrationsanfälligkeit und dem thermischen Verhalten aller opto-mechanischen Komponenten des Systems ab, einschließlich der Immersionsflüssigkeiten, die das Objektiv und die Probe verbinden. 

Unser Konsortium erforscht deshalb neue Materialien mit maximalen Schwingungsdämpfungseigenschaften, minimalen oder passenden thermischen Ausdehnungseigenschaften und, wenn sich all diese Maßnahmen als unzureichend herausstellen, neue Konzepte für Feedback-kontrollierte dynamische Neuanordnungen.

Stabilitätsprobleme treten auch aufgrund der Tatsache auf, dass die Bildaufnahme in der Einzelmolekülbildgebung sehr lange dauert. Jede Reduzierung der Bildaufnahmezeit wird daher also auch helfen, die Stabilitätsanforderungen auf eine Ebene zu reduzieren, die von Einrichtungen der medizinischen Routine-Diagnostik erbracht werden kann. Dieses Ziel wird durch Einbindung der neuen sCMOS-Kamera-Technologie adressiert, die mit speziell auf die Anwendung in der Einzelmoleküllokalisierung zugeschnittenen Auslesemodi kombiniert wird. 

Das Konsortium befasst sich mit der Vergrößerung der Auflösung nicht nur in zwei, sondern auch in drei Dimensionen. Der große Chip der sCMOS-Kamera erlaubt es, zwei Bilder von unterschiedlichen Fokuspositionen nebeneinander auf einen einzigen Chip zu projizieren, und durch die Verwendung passender Algorithmen erlauben es Differentialfokus-Aufnahmen zudem, die Genauigkeit der vertikalen Position bis in den Bereich von 20 nm zu reduzieren. Außerdem kann jedes dieser beiden, sich in der z-Position unterscheidenden Bilder in zwei Emissionsfarben geteilt werden und nebeneinander auf den großen sCMOS-Chip projiziert werden, was die Selektivität deutlich erhöht.

Die Technologieentwicklung wird durch die Firm- und Softwareentwicklung für FPGA-basierte Bildvorverarbeitung abgerundet. Das Ziel ist es, hochauflösende Bilder zu extrahieren, während Tausende von Lokalisierungsbildern aufgenommen werden. Dies wird mit einer neuen Einzelmoleküllokalisierungssoftware erreicht.

Diese neuartigen "Superresolution"-Technologien werden anhand von zwei bedeutenden Mikroskopieanwendungen validiert: 1) diagnostische bzw. experimentelle Pathologie am Beispiel von wichtigen Zellrezeptoren bei Brustkrebs and 2) Tumorimmunologie am Beispiel der "Lipid raft"-assoziierten Signaltransduktion in Lymphomen. 

In der ersten Berichtsperiode wurden von den Industriepartnern TILL I.D., TILL Photonics und Andor große Fortschritte in der Mikroskop-Hardware- und Software-Entwicklung für die Hochauflösungs- und Einzelmoleküllokalisierungstechniken gemacht. Die Anwendungspartner Niendorf und RUNMC haben zu untersuchende Fälle selektiert und Protokolle etabliert, die nun mit der REMEDI-Mikroskop-Plattform untersucht bzw. getestet werden können.

Die neuen Superresolution-Techniken bestimmen die genaue Position von vereinzelten Molekülen in einer Zelle mit einer Genauigkeit von ca. 20 nm und kombinieren mehrere Tausend dieser "insulären" Lokalisierungskarten zu einer globalen molekularen Karte des untersuchten Objekts. Da diese Techniken die Vorteile der optischen Mikroskopie (Lebendzellbeobachtung, Vielfarbenmikrokospie, 3-D Bildgebung) mit der Auflösung von Elektronenmikroskopen kombinieren, kann man sicher annehmen, dass sie in den kommenden Jahren nicht nur die Mikroskopie revolutionieren, sondern auch einen großen Einfluss auf die medizinische Diagnostik haben werden, da sich die meisten Krankheiten bis zum Versagen der molekularen Maschinerie, die zellulären Prozessen zugrunde liegt, zurückverfolgen lassen.

Diese neue Technologie wird es erlauben, diese molekularen Maschinerien direkt an ihrem natürlichen Ort zu untersuchen statt lose auf einem Chip. So wird das Gesichtsfeld eines Lichtmikroskops von einem makroskopischen Level, auf dem organismische Erscheinungen eine Krankheit widerspiegeln, bis hinunter zum molekularen Level erweitert, auf dem die krankheitsrelevanten molekularen Ereignisse stattfinden.

Das Projekt wird das Potential der "Superresolution"-Methode mittels zweier Pilotstudien erforschen. Die erste ist auf die hochaufgelöste immunhistochemische Färbung und Bildgebung von festen Tumorproben fokussiert. Die zweite ist gerichtet auf Protein- und Lipidstrukturen auf Nanoebene in Lymphomzellen sowie in Virus-infizierten Zellen. Das Ziel ist in beiden Fällen die Visualisierung von individuellen Proteinmolekülen und ihrer Wechselwirkung mit anderen Proteinen, die alle eine essentielle Rolle im untersuchten Krankheitsverlauf (Krebs bzw. Virusinfektion) spielen und daher feine, aber verlässliche Kriterien für die Diagnose, Prognose und Therapie darstellen können.